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  技术文章
 
RNAi的机理与应用

发布时间:2015-10-21 8:29:57
RNAi 技术的机理与应用

关于
 RNAi 技术

RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA( double-stranded RNA,dsRNA) 诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。

RNAi 受到追捧的原因主要有两个方面,一方面, RNAi 可以说是基因功能检验的试金石,利用 RNAi 技术可以缩短人类对人类基因功能的了解和认识的时间,在不久的将来有望将人类大部分基因的功能和作用全部弄清楚;另一方面,科研人员有望利用这种技术获得使致病基因失活的新型基因药物,而基因药物一直是生物技术界追捧的对象。

2002年,《自然》及《科学》两本重量级学术期刊把 RNA干扰技术视为生命科学领域重大突破,认为足以比肩 20 世纪早期发现抗生素,开启了基因治疗的另一个方向。

2006年10月,2006年度诺贝尔医学奖被授予美国斯坦福医学院病理学和遗传学教授安德鲁·菲尔和马萨诸塞州医学院分子医学教授克雷格·梅洛,表彰他们发现 RNAi机理。

RNAi迄今已对制药业和生物技术工业产生巨大影响。这也是诺贝尔奖评审委员会为什么不坚持研究成果要经过数十年实践验证的“惯例”,破格为菲尔和梅洛颁奖的原因之一。 

目前,RNA干扰治疗技术正在快速进入人体试验阶段,已有多个 siRNA 药物进入临床试验,其中第一个RNAi药物 Bevasiranib(美国 Acuity Pharmaceuticals 公司)已处于Ⅲ期临床试验阶段,有望于 2009 年获准上市。
 
RNAi 机理
 
遗传物质 ,化学名称是“脱氧核糖核酸”,简称 DNA 。 DNA 包含约二万多个蛋白质的密码。当细胞决定要制造某一个蛋白质之时,属于该蛋白质的 DNA 密码便会被“影印”(专业上称为转录 Transcription ),做成一份核糖核酸的“副本” RNA ,又叫 mRNA 。 mRNA 副本会去细胞内的蛋白质“工厂”(核糖体〔 Ribosome 〕),然后,按次序将二十种胺基酸组合成一个蛋白质。 

一些病毒觑准上述机制,把病毒的 RNA 送入细胞,借其核糖体,生产自己的蛋白质。这些以 RNA 储存遗传讯息的病毒,进入细胞后,会用一个自备的酶把 RNA 制造一个 DNA 的副本,以便可以衔接细胞“ DNA - mRNA - 蛋白质”的生产程序。对此,细胞也有对策。方法是用一个叫 Dicer 的酶,把入侵病毒的 RNA 切成很多小段;之后,这些小段 RNA 会很自然地、自动黏在它的 mRNA 上,干扰核糖体制造病毒的蛋白质。这便是一个细胞保护自己的机制,称为 RNA 干扰( RNA Interference - RNAi )。

RNAi 是 真核生物 中一种普遍存在且非常保守的机制 , 是一个天然的抗病毒机制。 RNAi 的作用机制可简述为“双链 RNA 降解 mRNA 从而阻断特定蛋白质的合成”,具体过程如下图:

 
首先,外源的或体内产生的长双链 RNA(long double stranded RNA, dsRNA) 首先被 Dicer 酶降解为长 21 ~ 23bp (碱基对)长度的小分子双链 RNA (称为小干扰核酸, small interfering RNA, siRNA), 这是一个依赖 ATP 的耗能过程。切割后的 siRNA 具有 3' 两个核苷酸 TT 突出末端。 

然后, siRNA 结合到核糖核酸酶复合物上形成 RNA 诱导的基因沉默复合体( RISC , RNA-induced silencing complex )。该复合体依赖 ATP 释能而解聚 siRNA 双链成单链以激活 RISC 。活化的 RISC 通过由 siRNA 决定的碱基互补配对原理切割具有同源序列的基因转录体,最终导致基因沉默效应。

同时, RNAi 过程中又有新的 dsRNA 分子合成 , 当 siRNA 反义链识别并结合靶 mRNA 后 , siRNA 反义链可作为引物 , 以靶 mRNA 为模板,在依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶 (RNA2dependent RNA polymerase , RdRP) 催化下合成新的 dsRNA , 然后由 Dicer 切割产生新的 siRNA , 新 siRNA 再去识别新一组 mRNA, 又产生新的 siRNA, 经过若干次合成切割循环 , 沉默信号就会不断放大。正是这种称为靶序列指导的扩增 (target2directed amplification) 机制赋予了 RNAi 的高效性和持久性。

siRNA 作为 RNAi 的中介分子,是一种具有 3' 两个核苷酸 TT 突出末端的 21 ~ 23bp 大小的双链核糖核酸,通过序列互补配对法则特异性降解目的基因。
 
RNAi 应用

RNAi 作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具, RNAi 的应用主要集中在两个方面:基因功能的研究、核酸干扰(RNAi)治疗。

• 基因功能研究
二十世纪最伟大的生物工程 --- 人体基因组工程,在美国主导和全球共同合作下,历经 15 年,耗资 300 亿美元,于 2000 年成功地将人体基因组的 30 亿个基因密码解析出来。虽然对总数约 3 万的人体基因的结构己清楚,但对于各种基因产物的功能如何?怎么在人体中发挥作用?哪些和疾病关联以及如何用于治疗疾病等诸如此类的问题还是束手无策。

与此同时,用基因工程学的方法修正或替换缺陷基因的基因疗法已成为基础和临床医学研究的热门课题。而实施基因疗法的前提是了解疾病相关基因 , 并用特定技术,如基因敲除 (gene knock-out) 验证其功能。

借助 RNAi 技术,研究者们可对目标基因进行特异性地表达沉默,通过观察其表达被抑制后细胞以至生物体从形态到各项生理生化的变化,对该基因的功能及参与的信号网络进行研究。与其他方法相比, RNAi 技术在基因功能研究上有其独特的优点 : ①简单易行 , 容易开展; ②与基因敲除相比,实验周期短、成本低;③与反义技术相比,具有高度特异性和高效性; ④可进行高通量 (high throughout) 基因功能分析。

• RNAi治疗

由于 RNAi 是针对转录后阶段的基因沉默,相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除,整个流程设计更简便,且作用迅速,效果明显,为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的 RNAi 机制,控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。

因此,寻找能导致特定基因沉默的 siRNA ,即可以此开发出特异性的高效 siRNA 药物。目前,多数药物的作用靶点为蛋白质 , 要研制这类药物必须对蛋白质的功能和结构有深入了解 , 而研制以 mRNA 为靶点的 RNAi 疗法则不会受制于蛋白质结构研究的进展。
 
RNAi 专业术语
核酸干扰 (RNA interference, RNAi)

核酸干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA ( double-stranded RNA , dsRNA) 诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。 RNAi 一经发现,迅速成为生物学研究领域最为活跃的热点之一,《 Science 》在 2001 年将其列为十大科学成就之一, 2002 年又将其列为十大科技之首; 《 Nature 》也将 siRNA 评为 2002 年度最重要的科技发现之一; 2006 年发现 RNAi 机理的两位美国科学家法尔和梅洛获得诺贝尔医学奖。

RNAi 技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,是一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具,已被广泛 用于探索基因功能、病毒性疾病(主要是艾滋病和肝炎)及恶性肿瘤的基因治疗领域。一方面, RNAi 是基因功能检验的试金石,利用 RNAi 技术可以大幅度缩短人类对人类基因功能与作用的了解和认识的时间;另一方面,可以利用 RNAi 技术获得使致病基因失活的新型基因药物,即 siRNA 药物。

小干扰核酸(siRNA)

小干扰核酸(英文缩写:siRNA ;中文简称:小核酸)是带有特定基因密码的双链短小核酸,一般长度为 21-23bp (碱基对)。 通俗地讲,一个基因通常含有有数千个 bp , siRNA 是其中长度为 21 ~ 23bp 的某一段特异序列。

siRNA 可以克隆到 siRNA 表达载体,其功能是在哺乳动物细胞内和特定靶基因的信使核糖核酸( mRNA )结合,使之降解,失去靶基因表达而“沉默”下来,即“关闭”该基因的功能。这种 siRNA 降解 mRNA 从而阻断特定蛋白质合成的机制即为核酸干扰( RNAi )。
 
 
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