欢迎访问常熟拂晓玻璃容器,我们是专业生产塑料试剂瓶,蓝盖试剂瓶及多孔螺旋盖,双层玻璃反应器,流动相溶剂瓶,色谱瓶,杂交管等的厂家。 回到首页 | 设为首页 | 加入收藏
网站首页 公司简介 产品展示 公司动态 技术文章 资料文章 招聘信息 资质证书 询价留言 联系方式
流动相溶剂瓶
多孔螺旋盖双层玻璃反应器杂交管流动相溶剂瓶色谱瓶
 
  产品分类
玻璃制品
  试剂瓶盖
  蓝盖试剂瓶
  棕色蓝盖试剂瓶
  冻干瓶
  血清瓶
  细胞滚瓶
  杂交管
  玻璃吸管
  丁基锂瓶
  玻璃层析柱
  玻璃离心管
棕色小口玻璃瓶
玻璃仪器
  微生物电池盒
色谱 样品瓶
  ND22 存储样品瓶
  ND20 钳口顶空样品瓶
  ND18螺旋顶空瓶
  13-425 螺旋口瓶
  11-425钳口瓶
  卡口系列
  9mm 短螺纹广口瓶
  8-425 小口螺纹瓶
  顶空瓶
PTFE硅胶复合垫片
塑料试剂瓶
  pp广口系列
  PP小口系列
  PE系列
振荡器/摇床
  恒温摇床
  冷冻摇床
  光照摇床
  金属恒温加热器
  分体式摇床
  迷你摇床
实验耗材
  吸头,吸头盒
  离心管,PCR管,离心盒
  冻存管,冻存盒
  巴氏吸管
  细胞培养皿 培养板
发酵罐专用补料瓶
  发酵罐补料瓶
  进口补料瓶
高鹏硅玻璃视筒
流动相溶剂瓶
  流动相色谱溶剂瓶
  进口色谱瓶
多孔螺旋盖高效液相色谱瓶
  多孔螺旋盖系列
非标玻璃容器定做
聚四氟乙烯制品
球磨口夹
  联系方式
联系人:陈先生
在线qq:点击这里给我发消息
在线旺旺: 点击这里给我发消息
手机:15371846806
电话:0512-87689026
传真:0512-52663517
网站Email:wenoote@163.com
网址:http://www.cnlabware.com
地址:常熟市碧溪镇碧周路58号
 
PTFE硅胶复合垫片
PTFE硅胶复合垫片
流动相溶剂瓶 2000ml
流动相溶剂瓶 2000ml
大口试剂瓶 大口样品瓶 …
大口试剂瓶 大口样品瓶 …
GL45多孔螺旋盖
GL45多孔螺旋盖
仿Nalgene方形试剂瓶
仿Nalgene方形试剂瓶
发酵罐专用补料瓶 4000m…
发酵罐专用补料瓶 4000m…
杂交管
杂交管
多孔螺旋盖及高效液相色…
多孔螺旋盖及高效液相色…
 
  技术文章
 
iRNA干扰GFP表达实验

发布时间:2013-8-28 20:56:08

实验原理

RNA沉默是发生在植物(转录后基因沉默或共抑制)、动物(RNA干扰,RNAi)和真菌(消除作用)等真核生物细胞中的的特异性和高效率的mRNA降解机制。在哺乳动物细胞中,RNAi通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能。将靶向特定基因的大约21碱基长短的双链siRNAs(smallinterferingRNAs),或者是45—50-mer的发夹结构RNA(smallhairpinRNA,shRNA)转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA,从而引发基因沉默或者表达抑制。通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。选用PolIII启动子启动编码shRNA(smallhairpinRNA)的序列。PolIII启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA,遇到4—5个连续的U即终止,非常精确。当这种带有PolIII启动子和shRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时,这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达,抑制范围包括外源基因和内源基因。

 

实验试剂

1. 双抗溶液(链霉素100μg 青霉素100单位)

2. DMEM培养基

3. 转染试剂(LIPOFECTAMINE2000)

4. 细胞培养基(DMEM 10%NCS)

5. PBS

6. 无血清培养基

7. 胰酶(Trypsin)

8. 小牛血清

 

实验设备

1. 培养皿

2. 移液管

3. 量筒

4. 恒温水浴箱

5. 离心机

6. 15ml离心管

7. 微量移液器

8. 荧光显微镜

9. 连续光谱荧光酶标仪

 

实验步骤

1. 寡核苷酸单链的设计及合成

采用Ambion公司的siRNATargetFinder(onlinetargetfinder)进行siRNA的设计,公司合成。

siRNATargetSequenceONE:5'-AAGGTGATGCTACATACGGAA-3'

SensesiRNAstrand:5'-GGUGAUGCUACAUACGGAAtt-3'

AntisensesiRNAstrand:3'-UUCCGUAUGUAGCAUCACCtt-5'

Positioningenesequence(cDNA):104

TopStrandOligonucleotideTemplate:(59mer)

5'-CGGTGATGCTACATACGGAATTCAAGAGATTCCGTATGTAGCATCACCTTTTTTGGTAC-3'

BottomStrandOligonucleotideTemplate:(59mer)

5'-CAAAAAAGGTGATGCTACATACGGAATCTCTTGAATTCCGTATGTAGCATCACCGGGCC-3'

2. shDNA的退火

用无核酶水稀释合成的单链寡核苷酸至200μmol/L

反应体系组成:

TopstrandDNAoligo(R)(200μmol/L)5μl

BottomstrandDNAoligo(F)(200μmol/L)5μl

10×OligoAnnealingBuffer2μl

DNase/RNasefreewater8μl

Totalvolume20μl

程序退火

95℃4min变性

90℃、80℃、70℃、60℃、50℃、40℃、30℃、20℃、10℃每10度递减,依次反应3min

4℃10min

-20℃保存

取1μl产物2%琼脂糖凝胶电泳,鉴定退火程度。

3. U6-shDNA质粒构建

用ApaI和KpnI双酶切含人源U6启动子的质粒,回收线性质粒。

用连接酶将步骤2退火片段与线性的载体连接。

在0.2ml或0.5ml反应管中加入下列成分

线性载体  50ng

shDNA 100ng

T4连接酶 2-3weissunits

10×连接缓冲液 1μl

补超纯水至总体积为10μl,常温下放置30分钟以上;也可以16℃或4℃过夜。

4. 转化细菌筛选阳性重组子。

5. 扩增含阳性重组子的细菌,提取质粒,备用。

6. 转染细胞。

7. 荧光显微镜观察GFP的表达变化,用荧光酶标仪测荧光强度的变化。

 
 
   首页 公司简介 产品展示 公司动态 技术文章 资料文章 招聘信息 资质证书 询价留言 联系方式 网站地图 html地图 tag: 多孔螺旋盖 双层玻璃反应器 流动相溶剂瓶 色谱瓶 杂交管
版权:常熟拂晓玻璃容器 电话:0512-87689026 传真:0512-52663517 邮箱:wenoote@163.com 地址:常熟市碧溪镇碧周路58号 技术支持:中国万网代理商

友情链接:

拂晓玻璃容器1站     不锈钢罐     深圳泰立     散装水泥罐     除尘袋毡圈     布料货架     太仓吊顶     常熟吊顶     苏州要账公司