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siRNA转染的常见问题解答

发布时间:2013-8-28 20:57:14

本文收录了与siRNA转染相关的常见问题,并附上QIAGEN专家的解答,希望能对您的实验有帮助。

Q:我该如何优化siRNA转染?

A:在实验室中建立RNAi和研究每一种新的细胞系时,应当优化siRNA的转染。HiPerFect Transfection Reagent Handbook中包含优化的有用信息。在优化实验中,转染效率可通过阳性对照(如AllStars Cell Death Control siRNA)的转染来监控。

应当优化的转染因素包括

试剂和siRNA的量
转染时的细胞汇合度
分析前细胞和复合物的孵育时间
Q:转染少量的siRNA为何很重要?

A:高浓度的siRNA转染可能产生脱靶效应,即siRNA影响了部分同源或非同源基因的表达。研究表明,可能会对RNAi实验产生误导结果的脱靶效应可通过降低siRNA浓度而在很大程度上避免(1,2)。HiPerFect Transfection Reagent有助于siRNA的高效吸收,实现了低浓度下的基因沉默,而不损害knockdown的效率。

Q:在siRNA转染过程中为何应当避免细胞毒性?

A:siRNA导入所引起的细胞毒性干扰了RNAi后的数据分析,因为表型分析不再可靠。影响数据分析的因素包括转染试剂所引起的表型改变,压力所引起的基因表达改变,以及不应当用于分析的死细胞的存在。

HiPerFect Transfection Reagent对细胞无毒性,不会引起液泡形成(这标志着细胞进程的破坏)。详细的细胞周期和细胞形态学分析显示mock转染的细胞(只有HiPerFect Transfection Reagent)和未转染的细胞之间无差异。

Q:顺式转染和反式转染之间有什么差别?

A:在反式转染的步骤中,siRNA先加在平板的孔中,然后才是转染试剂。在复合物形成之后,加入细胞。顺式转染则相反,先在孔中加入细胞,然后才是复合物。反式转染使用广泛,特别对于高通量实验,因为它容易自动化,转染前siRNA可储存在孔中,且使用了较少的材料,因为不需要在一块单独的板上开展siRNA-转染试剂复合物的形成。

 
 
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