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致癌化学物、病毒和癌基因等方法转化细胞的技术

发布时间:2013-9-13 21:08:06

1)致癌化学物转化细胞:转化叙利亚地鼠胚胎细胞实验
1.取材:妊娠后第13天取材,取数个同窝胚胎,去头和内脏,在无菌条件下剪碎至米粒大小,再用0.25%胰蛋白酶 (含0.01%EDTA )37℃ 消化30分钟,滤过、低速离心、吸除消化液、加入营养液、制备成细胞悬液、接种入75cm/培养瓶 中,接种密度10~20×106/75cm,37℃培养 2~3天,在顺利情况下能迅速长满瓶面。

2.贮存:选大批生长状态良好的细胞冻存,储以备用。

3.致癌物处理:取冻存细胞,解冻,接种于25ml培养瓶 中,每瓶含细胞10万~30万。待细胞生长进入指数增生期时,向培养瓶中加入致癌剂MNNG。致癌剂量1~3微克/毫升营养液。在37℃温箱中培养12~48小时。

4.低血清 培养:弃掉MNNG作用液,用温PBS洗1~3次,加入含20%小牛血清 ,继续置温箱中培养2~3周,然后改用含5%血清培养液培养。低血清培养液不利于正常细胞生长,但已转化的细胞仍能增殖和形成转化灶。

5.转化灶形成和分离:在成功情况下,用致癌物处理过的细胞于10天后在正常细胞之间,可产生数量不等的转化灶。

2)病毒转化细胞

1.血液制备:柠檬酸(Citric Acide)或肝素抗凝取血1~2ml,分装入管中,每管0.5ml全血,置于4℃冰箱中30分钟。

2.EBV病毒转化:从液氮中取出冻存的0.5ml全血,在37℃水中迅速解冻。

3.将解冻细胞与10ml不含血清的RPMI 1640混合,2500 rpm离心2分钟,弃上清,用含20%的胎牛血清、青、链霉素和庆大霉素的RPMI 1640生长培养基重悬细胞。

4.加入0.3~0.5ml的EBV病毒液,37℃水浴 30分钟~2小时,并不时摇动,以免出现凝块。

5.分装入50ml的培养瓶中,同时补加适量培养液,置入含5%CO2温箱中,100%温度下培养。

6.一周后加补入2ml培养基。

7.经常镜检培养物,每3~4天加液或换液,随细胞数量增多,可分装入大瓶中培养。

3) 癌基因转化细胞:基因组DNA转染法

1.提取基因DNA(含癌基因)。

2.DNA准备:取供体DNA50~100微克,加3M NaCl或醋酸钠使最终浓度至0.3M混匀。

3.再加2倍体积无水乙醇,3000转/分离心10分钟,去上清。

4.加入转染缓冲液,待DNA充分融解后,再加入2.5M CaCl2,令最终浓度为125mM,用吸管 轻轻吹打三次。置室温下10~30分钟,待液体透明度降低,出现微浊蓝色时,即可用于转染受体细胞。

5.细胞:取生长状态良好、处于半汇合阶段的指数增生期细胞,在转染前24小时,更换培养液1次。

6.转染:向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.5~1ml/瓶,置37℃作用4~6小时。

7.培养:弃去培养液,用15%甘油处理3分钟,无血清培养漂洗1次,加入新培养液,37℃温箱培养24小时。

8.传代:按1:5或1:10分瓶传代,每2~3天换液1次,接近汇合时血清用量降至5%,培养2~3周。

9.检测:逐日观察,待出现转化灶后,分离入另瓶中培养。

 
 
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