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微载体培养技术

发布时间:2013-9-29 11:30:27

Biodiscover • 生物探索
微载体培养技术(micro-carrier culture technique)于1967年被用于动物细胞大规模培养。经过三十余年的发展,该技术日趋完善和成熟,广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体以细小的颗粒作为细胞载体,通过搅拌悬浮在培养液内,使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术。微载体培养是目前公认最具发展前途的一种动物细胞大规模培养技术,其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点,且容易放大。该技术已广泛用于培养各类型细胞。

.微载体培养原理
Biodiscover • 生物探索

微载体是指直径60-250 μm,能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。增大单位体积的表面积(S/F)对细胞的生长非常有利,因此微载体直径尽可能小。微载体加入到培养容器的培养液中,作为载体,使细胞在微载体表面附着生长,同时通过持续慢速搅动使微载体始终保持悬浮状态。微载体培养技术兼容了悬浮培养和贴壁培养两种形式,极大的提高了培养基、培养罐的利用率。

贴壁培养:贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖,要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖,故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附,主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。
.搅拌转速:由于动物细胞无细胞壁,对剪切力敏感,因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是:在贴壁期采用低搅拌转速,时搅时停;数小时后,待细胞附着于微载体表面时,维持设定的低转速,进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢,最大速度75r/min。

细胞与微载体的相融性,是与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理PH值时,表面带负电荷。若微载体带正电荷,则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷,因静电斥力使细胞难于黏附贴壁,但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时,则带负电荷的细胞也能贴附。

..微载体培养操作要点
Biodiscover • 生物探索

培养初期:保证培养基与微球体处于稳定的PH与温度水平,接种细胞(对数生长期,而非稳定期)至终体积1/3的培养液中,以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微载体含量,更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。

贴壁阶段(3-8d)后,缓慢加入培养液至工作体积,并且增加搅拌速度保证完全均质混合。 培养维持期:进行细胞计数(胞核计数)、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随意细胞增殖,微球变得越来越重,需增加搅拌速率。经过3d左右,培养液开始呈酸性,需换液:停止搅拌,让微珠沉淀5min,弃掉适宜体积的培养液,缓慢加入新鲜培养液(37℃),重新开始搅拌。

收获细胞:首先排干培养液,至少用缓冲液漂洗1遍,然后加入相应的酶,快速搅拌(75-125r/min)20-30min。然后解离收集细胞及其产品。

微载体培养的放大:可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素,已被放大至4000L以上。

.收获微载体培养的成骨细胞
.微载体生物反应器系统
Biodiscover • 生物探索

此技术大规模培养,细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制,其中主要的限制性因素包括:细胞对剪切力的敏感性、氧的传递以及传代和扩大培养等。而研制的各种类型生物反应器系统则可针对上述限制性因素,为微载体细胞培养与扩增提供低剪切力、高氧传递效率、易于细胞传代等适宜的外部环境。

已较多使用的微载体培养系统生物反应器,可以实行计算机控制操作,培养搅拌速度及悬浮均匀程度、温度变化、PH稳定及溶氧供应(O2、N2、CO2、空气四种纯化气体按比例调节)、罐压、培养体积和通气量等参数全部由电脑自动控制。因此,应用生物反应器系统进行微载体细胞大规模扩增具有明显优势,目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统,如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统以及灌注式生物反应器系统等。

1、搅拌式生物反应器系统:搅拌式生物反应器系统在微载体细胞大规模扩增研究领域已有较长的研究历史,但因该细胞培养系统容易产生过大的剪切力,从而限制了其应用范围。尽管如此,由于该系统具有简单、实用及价格低廉等特点,国内外仍有不少应用该系统成功进行细胞大规模扩增的研究报道。

2、灌注式生物反应器系统:灌流培养是目前研究热点之一。它的特点是不断地加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗培养基,使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内增殖,即省时省力,又减少了细胞发生污染的机会,且可以提高细胞密度10倍以上。

3、旋转生物反应器:近年来,旋转生物反应器系统(RCCS)已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养,又能在其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体。至今,近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。
.微载体培养的优势
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产业化细胞培养首先需要提供足够大的细胞生长面积,使培养容器单位容积所提供的细胞生长面积有所增加,从而提高疫苗和生化制剂的产量。微载体表面积/体积(S/V)大,融合了悬浮培养和贴壁培养两种要素。其次,便于观察细胞在微珠表面的生长情况,简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制,重现性好,有利于细胞生长控制。第三,细胞的均一化程度要高,细胞的放大和收获过程简化。要满足以上三点要求,常规的培养瓶静态培养, 甚至是转瓶都很难满足,而微载体培养技术则能很好的解决这些问题。
.技术支持
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本专题部分资料来源于康宁生命科学部。康宁公司是特殊玻璃和陶瓷材料的全球领导厂商。康宁创造并生产出了众多被用于高科技消费电子、电信和生命科学领域产品的关键组成部分。康宁微载体专为简化大规模细胞培养流程而设计。无菌,可直接用于生物反应器。此外,该微载体经过表面处理可增强细胞吸附,实现最优细胞产量和最高细胞活力。

 
 
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